Tháng 2 năm Giáp Thìn (1784), Nguyễn Ánh sang Xiêm La hội kiến với vua Xiêm La là Chất Tri (Chakri, Rama I) tại Vọng Các (Bangkok). Vua Xiêm sai hai tướng là Chiêu Tăng, Chiêu Sương đem 2 vạn quân thủy cùng 300 chiếc thuyền sang giúp. Ngoài ra còn có 3 vạn quân bộ tiến sang Chân Lạp với danh nghĩa giúp vua Chân Lạp, nhưng thực chất ý đồ nhằm tạo gọng kìm phía tây, chờ cơ hội tiêu diệt quân Tây Sơn.[44]

Quân Xiêm nhanh chóng lấy được Rạch Giá, Ba Thắc, Trà Ôn, Mân Thít, Sa Đéc, ra tay cướp phá bừa bãi.[44] Tướng Tây Sơn giữ đất Gia Định là phò mã Trương Văn Đa[h], thấy quân Xiêm thế lực mạnh, bèn cố thủ tại Gia Định và sai người về Quy Nhơn báo. Vua Tây Sơn sai Nguyễn Huệ đem binh vào chống giữ.

Sau khi vào Gia Định, Nguyễn Huệ đánh vài trận nhưng không thắng, có ý rút binh nhưng gặp dịp một tướng của Nguyễn Ánh là Lê Xuân Giác về hàng bày mưu phục binh.[45] Mưu hợp với ý của Nguyễn Huệ nên ông nghe theo, liền cho bố trí trận địa và nhử quân Xiêm đến gần Rạch Gầm và Xoài Mút[45] (ở phía trên Mỹ Tho) để đánh một trận lớn tiêu diệt quân Xiêm.

Đêm 19 rạng 20 tháng 1 năm 1785 (đêm 9 rạng 10 tháng 12 năm Giáp Thìn), quân Xiêm lợi dụng thủy triều xuôi theo dòng sông để tấn công Mỹ Tho nhằm phá vỡ đội thuyền phòng thủ của Tây Sơn. Quân Tây Sơn giả thua rút dần về hướng Mỹ Tho, nhử đối phương lọt vào trận địa mai phục đoạn Rạch Gầm-Xoài Mút. Quân Xiêm quen mùi thắng nên tiến vào trận mai phục của Tây Sơn,[45] khi quân Xiêm lọt vào trận mai phục, bất ngờ quân Tây Sơn sử dụng pháo bắn uy hiếp dữ dội ở cù lao Thới Sơn và bờ sông Tiền, khóa chặt hai đầu, dồn quân Xiêm vào thế "tiến thoái lưỡng nan". Bên cạnh đó, pháo hỏa hổ ở hai bên bờ nã đạn tới tấp vào đội hình làm quân Xiêm rối loạn, tinh thần hoang mang rồi bỏ chạy. Cùng lúc đó, một đội thuyền cảm tử chở đầy rơm và những vật liệu dễ cháy đâm thẳng vào thuyền quân Xiêm làm cho số bị chìm, số bị cháy. Trong khi đó, cánh quân bộ Xiêm La ngay từ đầu đã bị quân Tây Sơn chặn đánh không cho cứu viện.

Một trận quyết chiến diễn ra trong không đầy một ngày đã tiêu diệt gần như hoàn toàn 2 vạn quân Xiêm,[44] số còn sống sót chỉ được vài nghìn người[45] chạy theo đường thượng đạo trốn về nước. Cánh quân bộ nghe tin thất trận cũng tan rã và tháo chạy. Nhị Vương Xiêm La Chiêu Tăng, Chiêu Sương chạy theo đường bộ về Xiêm; còn Nguyễn Ánh phải chạy ra đảo Thổ Chu rồi về Cổ Cốt được Cai cơ Trung đón sang Xiêm.[45]

Sau trận đánh này, quân Xiêm khiếp đảm trước sức mạnh của Tây Sơn, "ngoài miệng thì nói khoác nhưng trong bụng thì sợ quân Tây Sơn như sợ cọp".[45] Đánh dẹp xong, Nguyễn Huệ đem quân về Quy Nhơn để đô đốc là Đặng Văn Trấn ở lại trấn đất Gia Định.